Основан по указу Ивана Грозного новгородским архиепископом Пименом. Работами по устройству обители руководил богомольный новгородский ктитор Фёдор Сырков (казнен Иваном Грозным во время опричного погрома Новгорода). Срокам строительства придавалось особое значение, поэтому царь разрешил на всех видах работ использовать крестьян из двадцати волостей.
Главной реликвией монастыря является чудотворная Тихвинская икона Божией Матери Одигитрии. Во время крестных ходов, тем не менее, в монастыре использовалась выносная икона. Согласно одному из преданий, она в течение 200 лет находилась в Старой Руссе в Спасо-Преображенском мужском монастыре (или же в Воскресенском соборе города), но была перенесена в Тихвин. Якобы во время мора в Старой Руссе и Тихвине некоему «благоговейному мужу» было видение свыше, что бедствие прекратится, если иконы Божией Матери в Старой Руссе и Тихвине поменяются местами. После этого список Тихвинской иконы была принесён в Старую Руссу, а старорусская икона — в Тихвин; вскоре после этого мор, согласно преданию, прекратился.